砂梨对高温胁迫的响应及耐热机理研究

【摘要】梨是我国重要的栽培果树,除海南省外全国各省(市、区)均有栽培。砂梨、白梨、秋子梨和新疆梨是原产我国的四大栽培梨系统,其中,砂梨原产于我国长江流域及其以南地区,适应高温、高湿的环境,在我国南方地区广泛栽培。虽然砂梨对环境的适应性较强,但气候因素仍然是限制产量和品质的主要原因,尤其是果实发育关键期的异常温度变化,如花期低温冻害、高温导致的授粉受精不良,果实近成熟期极端高温天气导致的果实大量落果及日烧,果实采收后的早期落叶、抽发新梢及二次开花等,这些现象的产生可能均与高温天气有关。近年来随着全球气候温暖化的加剧,我国南方地区夏季极端高温天气越来越频繁,这给砂梨产业带来的影响也愈发明显。因此,开展砂梨的高温适应性研究将有助于改善栽培管理措施提高果实品质。本试验首先以砂梨品种‘翠冠’和‘园黄’为材料,研究两种高温胁迫方式对砂梨叶肉细胞超微结构、叶绿素相对含量、叶绿素荧光参数以及净光合速率的影响,两种高温胁迫方式分别为短期持续高温胁迫(40℃,48h)和长时间高温胁迫(11：00-17：00,40℃,6d)。结果表明：短期持续高温胁迫后叶肉细胞内脂质体、嗜锇颗粒增加；叶绿体肿胀变形、淀粉粒不充实；细胞核内染色质固缩；生物膜系统被破坏,尤其是叶绿体类囊体膜和线粒体内膜明显膨胀；另外,叶片光合结构的器质性损伤也导致叶片光合能力下降,主要表现为叶绿素相对含量(SPAD)、净光合速率(Pn)和光系统Ⅱ的最大光化学速率(Fv/Fm)下降。而且,不同砂梨品种的叶片光合系统对短期持续高温胁迫的适应性存在差异,胁迫处理后‘翠冠’叶片中叶绿体的损伤率为55%,‘园黄’中为57%。长时间高温胁迫处理对叶肉细胞超微结构的损伤程度较轻,但是叶片净光合速率和光系统Ⅱ的最大光化学效率仍然有所下降。为了进一步探究不同砂梨品种对高温胁迫响应的差异性,以‘翠冠’和‘园黄’为材料在长时间高温胁迫条件下研究砂梨叶片的耐热机理。结果表明：高温胁迫后砂梨叶片中过氧化氢(H2O2)明显积累,丙二醛(MDA)含量显著增加,这说明高温胁迫下砂梨叶肉细胞的生物膜系统受活性氧伤害。高温胁迫后,酶促抗氧化系统中的抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性在‘翠冠’叶片中显著提高,而在‘园黄’叶片中变化不显著。从‘翠冠’叶片中分离得到6条APX同工酶基因,基于氨基酸序列构建APX系统发育树,发现APX同工酶按照其亚细胞定位分为三个亚族,分别为胞质APX(cAPX)叶绿体APX(cpAPX,包括位于叶绿体基质中的sAPX和类囊体膜上的tAPX)和过氧化物酶体APX(pAPX).在扩增到的6条APX基因中,3个编码cAPX(pcAPX1、PpcAPX2和PpcAPX3),1个编码pAPX(PppAPX),2个编码cpAPX(PpsAPX和PptAPX)。在烟草瞬时表达系统中证实cAPX1和sAPX分别定位于细胞质和叶绿体中。在APX基因的启动子区域发现多种与胁迫反应相关的顺式作用元件,而且顺式作用元件的种类、位置和出现频率在不同成员间有所差异。另外,高温胁迫下,‘翠冠’叶片中PpcAPX2-3,PppAPX,PpsAPX和PptAPX的诱导表达与APX酶活性变化趋势一致,但是在‘园黄’叶片中APX基因成员的诱导表达模式不明显,这是造成砂梨品种耐热差异性的原因之一。为了进一步研究砂梨叶片耐热性形成的机制,本文在蛋白质组学的水平上研究亚高温锻炼和过氧化氢预处理对砂梨叶片耐热性形成的影响。高温胁迫后大多数下调表达差异蛋白均与光合作用和逆境应答反应有关,这说明高温胁迫后叶片光合作用受到抑制并启动逆境应答机制。高温胁迫后叶片中上调表达的蛋白主要为热激蛋白,包括Hsp17.5,Hsp17.8和Hsp70,而且热激蛋白的上调表达主要受热激转录因子HsfA2的调控。基于砂梨品种的耐热差异性,选择耐热性较差的‘园黄’梨为材料研究高温胁迫对果实品质形成的影响。结果表明：高温胁迫后,因叶片光合能力的下降,砂梨叶片中主要的光合作用产物山梨醇含量明显降低,这主要是由山梨醇合成代谢中依赖于NADP+的山梨醇-6-磷酸脱氢酶(S6PDH)活性降低和分解代谢中依赖于NAD+的山梨醇脱氢酶(NAD+-SDH)活性增加导致；而果实中只有NAD+-SDH活性略有下降。从‘园黄’材料中分离得到1个S6PDH基因(PpS6PDH)、3个NAD+-SDH基因(PpSDH1-3)和2个山梨醇转运蛋白(SOT)基因(PpSOT1-2),而且这些基因对高温胁迫具有组织特异性响应。高温胁迫后叶片中PpS6PDH的表达受到抑制但在果实中没有显著变化,叶片中PpSDH1和PpSDH3表达量增加使NAD+-SDH活性增强而果实中PpSDHl和PpSDH2的表达量下降使NAD+-SDH活性降低。高温胁迫下叶片中PpSOT2的表达量下降,这表明叶片中山梨醇的卸载过程受高温抑制。高温胁迫下,叶片及果肉中的蔗糖代谢也发生变化,叶片中伴随山梨醇合成代谢的减弱,蔗糖合成代谢增强,由此推测叶片中山梨醇合成代谢与蔗糖合成代谢可能存在此消彼长的关系,而且叶片及果肉中的蔗糖积累均是由蔗糖合成酶(SUS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性增加引起的。
【作者】刘冬峰；
【导师】滕元文；
【作者基本信息】浙江大学，果树学，2014，博士
【关键词】砂梨；高温胁迫；叶肉细胞超微结构；光合作用；抗坏血酸过氧化物酶；获得性耐热性；山梨醇代谢；蔗糖代谢；

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